L’RNA messaggero nelle nanoparticelle lipidiche salva le cellule HEK 293 dai lipidi

Scientific Reports volume 12, numero articolo: 22293 (2022) Citare questo articolo

2220 accessi

5 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Gli strumenti analitici per studiare la fisiologia cellulare sono fondamentali per ottimizzare le interazioni farmaco-ospite. La spettroscopia NMR con inseguimento di impulsi in tempo reale, RTPC-NMR, è stata introdotta per monitorare la cinetica della produzione di metaboliti nelle cellule HEK 293T trattate con nanoparticelle lipidiche simili al vaccino COVID-19, LNP, con e senza mRNA. I parametri del flusso cinetico sono stati risolti per l'incorporazione dell'etichetta isotopica nei metaboliti e l'eliminazione dei metaboliti marcati dalle cellule. I cambiamenti nei tempi caratteristici della produzione di alanina hanno implicato una disfunzione mitocondriale come conseguenza del trattamento delle cellule con nanoparticelle lipidiche, LNP. La disfunzione mitocondriale è stata ampiamente ridotta dall'inclusione dell'mRNA negli LNP, la cui presenza ha aumentato le dimensioni e l'uniformità degli LNP. La metodologia è applicabile a tutte le cellule in coltura.

Il notevole successo dei vaccini contro il COVID-19 basati su nanoparticelle lipidiche mRNA modificate con pseudouridina, LNP, che sfruttano il meccanismo traslazionale innato alimentato dal metabolismo cellulare, spinge questa tecnologia in prima linea nella medicina1,2,3,4,5,6 . Sono state testate molte potenziali applicazioni degli LNP mRNA per il trattamento di malattie croniche come il diabete7,8,9, tumori e disturbi genetici10,11. Le terapie basate sull'RNA messaggero utilizzano un insieme complesso di molecole biologiche che devono essere ottimizzate per ogni applicazione. Possono queste cellule superare le cellule circostanti per le scarse risorse nutritive nei tessuti viventi? Quanto durerà la produzione effettiva dei prodotti genici dell'mRNA? La degradazione degli LNP dell’mRNA, che rilascia metil pseudouridina, inibirà la trascrizione? I lipidi che costituiscono gli LNP danneggeranno il plasma e le membrane cellulari interne? Questi problemi sono critici e devono essere affrontati per facilitare l’implementazione terapeutica.

La risposta dinamica delle cellule ai trattamenti farmacologici può essere valutata mediante il profilo metabolico, che viene generalmente ottenuto utilizzando la spettroscopia di massa o la spettroscopia NMR12,13. La metodologia richiede in genere la lisi e l'estrazione cellulare per rilevare le concentrazioni totali di metaboliti, fornendo istantanee della fisiologia cellulare per un periodo di ore o giorni che è intrinsecamente distorto a causa dei processi a più fasi necessari per preparare i campioni12,13. La metodologia invasiva sconvolge la struttura compartimentale delle reti metaboliche e potrebbe non riflettere i processi reattivi che hanno luogo dopo l’assunzione del vaccino basato su LNP. La spettroscopia NMR in tempo reale utilizza l'abbondanza naturale di 13C o analisi basate su traccianti per identificare i metaboliti raccogliendo spettri 1H modificati con isotopo 13C dalle cellule, consentendo una rapida acquisizione dei dati, aumentando così la risoluzione temporale degli esperimenti a 10 minuti o meno14,15.

Studi metabolomici più recenti basati su NMR in tempo reale utilizzano un bioreattore per mantenere le cellule in uno stato fisiologicamente attivo e possono rilevare metaboliti intracellulari liberi, ma non hanno la capacità di monitorare reazioni chiave come la glicolisi che avvengono nel corso di minuti16,17,18 . L'introduzione della spettroscopia NMR con inseguimento di impulsi in tempo reale, RTPC-NMR, combina l'uso di 13C-glucosio e NMR di protoni modificati con 13C con una criosonda NMR ultrasensibile19 e il design migliorato di un bioreattore20 per aumentare la risoluzione temporale degli esperimenti a 47 s consentendo rapidi cambiamenti nei flussi metabolici in risposta agli stimoli da seguire. I metaboliti marcati con 13C vengono osservati su uno sfondo non marcato. Questo metodo rappresenta l'avanguardia della tecnologia per analizzare la salute cellulare catturando le dinamiche dell'incorporazione del carbonio 13C in modo imparziale per rivelare come gli stimoli influenzano le vie metaboliche.

L'mRNA della luciferasi modificato contenente N1-metilpseudouridina invece dell'uridina è stato preparato mediante trascrizione in vitro sulla base di un protocollo precedentemente pubblicato21,22 ed è stato utilizzato per tutti gli esperimenti. L'incorporazione di N1-metilpseudouridina aumenta la stabilità dell'mRNA e migliora l'espressione proteica nelle cellule di mammifero22,23. La trascrizione purificata includeva una coda poli(A) da ~ 150 nucleotidi 3' e Cap124 da 5' per facilitare ulteriormente la traduzione delle proteine ​​(Figura 1 supplementare). L'mRNA modificato è stato trasfettato in cellule HEK 293T per 24 ore utilizzando cinque reagenti di trasfezione (Fig. 1a, Tabella supplementare 1). Le cellule HEK 293T erano precedentemente utilizzate per monitorare l'assorbimento e l'espressione dell'mRNA della luciferasi21,22. Coerentemente con Kariko et al.21,22, solo un reagente, Lipofectamina 2000, LF, ha fornito mRNA sufficiente nelle cellule per generare un segnale di luminescenza dipendente dalla luciferasi.