L'inibitore dell'aldolasi aldometanib imita la carenza di glucosio per attivare l'AMPK lisosomiale

Nature Metabolism volume 4, pagine 1369–1401 (2022)Citare questo articolo

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L'attività della proteina chinasi attivata da 5′-adenosina monofosfato (AMPK) è inversamente correlata alla disponibilità cellulare di glucosio. Quando i livelli di glucosio sono bassi, l’enzima glicolitico aldolasi non si lega al fruttosio-1,6-bifosfato (FBP) e, invece, segnala di attivare l’AMPK lisosomiale. Qui, mostriamo che il blocco del legame dell'FBP all'aldolasi con la piccola molecola aldometanib attiva selettivamente il pool lisosomiale di AMPK e ha effetti metabolici benefici nei roditori. Identifichiamo aldometanib in uno screening per gli inibitori dell'aldolasi e mostriamo che impedisce al FBP di legarsi all'aldolasi associata a v-ATPasi e attiva l'AMPK lisosomiale, imitando così uno stato cellulare di carenza di glucosio. Nei topi maschi, aldometanib induce un effetto ipoglicemizzante insulino-indipendente, senza causare ipoglicemia. Aldometanib allevia anche il fegato grasso e la steatoepatite non alcolica nei roditori maschi obesi. Inoltre, aldometanib prolunga la durata della vita e la durata della salute sia nei topi che nei Caenorhabditis elegans. Nel loro insieme, aldometanib imita e adotta la via di attivazione dell’AMPK lisosomiale associata alla carenza di glucosio per esercitare ruoli fisiologici e potrebbe avere un potenziale come terapeutico per i disturbi metabolici negli esseri umani.

L'AMPK è un regolatore fondamentale dell'omeostasi metabolica1,2,3. Comprende un complesso eterotrimerico di una subunità α catalitica e subunità regolatrici β e γ, tra le quali la subunità γ fornisce siti di legame per i nucleotidi adenina regolatori AMP, ADP e ATP, la cui occupazione dipende dall'AMP cellulare: ATP e Rapporti ADP:ATP4,5,6,7,8. A seconda dei livelli di glucosio cellulare e degli stati energetici, l'AMPK è regolato in modo spaziotemporale gerarchico9,10,11,12. Con livelli di glucosio e quindi di FBP in diminuzione, ma prima che l'energia cellulare diventi limitata, l'AMPK localizzato lisosomiale viene attivato tramite l'asse di attivazione lisosomiale13,14. In questo asse, la mancanza di FBP è rilevata direttamente dall'aldolasi vacuolare associata all'H+-ATPasi (v-ATPasi) della pompa protonica lisosomiale, che a sua volta blocca la sottofamiglia V (TRPV) del recettore del potenziale transitorio del canale del calcio localizzato nel reticolo endoplasmatico (ER) , convertendo il basso glucosio cellulare in un segnale basso di calcio al contatto ER-lisosoma14,15. TRPV interagisce quindi con v-ATPasi, provocando una riconfigurazione del complesso aldolasi-v-ATPasi, con conseguente inibizione di v-ATPasi15. Pertanto, AXIN utilizza v-ATPasi e il suo Ragulator associato (composto da cinque subunità LAMTOR, LAMTOR1–5) come siti di aggancio per legare la chinasi epatica B1 (LKB1), una chinasi a monte AMPK13,16. Ciò porta alla fosforilazione dell'AMPK in Thr172 e alla sua attivazione. È importante sottolineare che l'attivazione dell'AMPK lisosomiale avviene in vivo in varie condizioni fisiologiche come la fame e la restrizione calorica14,17. Una volta che i livelli di energia cellulare sono bassi, l'aumento di AMP provoca cambiamenti allosterici nell'AMPK, che gli consentono di formare un complesso con l'AXINA legata a LKB1 nel citosol indipendentemente dalla via lisosomiale, portando all'attivazione del pool citosolico di AMPK oltre al pool lisosomiale9,16. In caso di grave stress dovuto a condizioni quali fame estrema e ischemia, viene attivato anche l'AMPK mitocondriale, in modo indipendente dall'AXIN9,18,19. Una volta attivato, l'AMPK fosforila direttamente più bersagli per inibire l'anabolismo e stimolare il catabolismo, riducendo così al minimo il consumo di ATP e stimolando la produzione di ATP per mantenere l'omeostasi energetica1,3. Ad esempio, le acetil-CoA carbossilasi (ACC1 e ACC2) sono substrati dell'AMPK per l'inibizione della sintesi degli acidi grassi e la promozione dell'ossidazione degli acidi grassi in condizioni di stress glucosio/energia20. L'AMPK fosforila anche la proteina legante l'elemento regolatore dello sterolo del fattore di trascrizione (SREBP)-1c per sopprimere la sintesi degli acidi grassi a livello trascrizionale21. Inoltre, l'attività di AMPK contribuisce anche all'inibizione del bersaglio del complesso 1 della rapamicina (TORC1) e quindi della sintesi proteica mediante fosforilazione del complesso della sclerosi tuberosa e della subunità Raptor di TORC1 in condizioni di carenza di glucosio22,23. Oltre a bloccare i processi anabolici, l'AMPK fosforila substrati come il membro 1 della famiglia del dominio TBC1 (TBC1D1) per promuovere l'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico24,25 per aumentare la glicolisi26. Inoltre, l'AMPK promuove l'autofagia, sia attraverso la fosforilazione diretta dell'autofagia simile a unc-51 che attiva la chinasi 1 e Beclin-1, sia attraverso l'inibizione del complesso TORC127,28,29. L'AMPK esercita anche un ruolo fondamentale nel promuovere la biogenesi mitocondriale attraverso l'aumento dei livelli cellulari di NAD+ per l'attivazione delle sirtuine, promuovendo così la fosforilazione ossidativa e massimizzando l'efficienza della produzione di ATP30,31. I ruoli dell'AMPK nell'inibizione di TORC1, nell'avvio dell'autofagia, nell'elevazione del NAD+ e nell'attivazione delle sirtuine sono stati tutti implicati nella longevità32. Queste azioni pleiotropiche suggeriscono che l'AMPK è un potenziale bersaglio terapeutico per il trattamento di disturbi metabolici come il diabete e la malattia del fegato grasso33,34,35.

30%) on kinases examined (Supplementary Table 1)./p>3 g) over a period of 1 week; or (e) a severely ulcerated or bleeding tumour. Mice found dead were also noted at each daily inspection./p>

28%, vol/vol) in the LC–MS-grade water (mobile phase A) and LC–MS-grade 90% (vol/vol) acetonitrile in LC–MS-grade water (mobile phase B) run at a flow rate of 0.2 ml min−1. Metabolites were separated with the following HPLC gradient elution programme: 95% B held for 2 min, then to 45% B in 13 min, held for 3 min, and then back to 95% B for 4 min. The mass spectrometer was run on a Turbo V ion source in negative mode with a spray voltage of −4,500 V, source temperature of 550 °C, gas no.1 of 50 psi, gas no. 2 of 55 psi and curtain gas of 40 psi. Metabolites were measured using the MRM mode, and declustering potentials and collision energies were optimized through use of analytical standards. The following transitions were used for monitoring each compound: 505.9/158.9 and 505.9/408.0 for ATP; 425.9/133.9, 425.9/158.8 and 425.9/328.0 for ADP; 345.9/79.9, 345.9/96.9 and 345.9/133.9 for AMP, 662.0/540.1 for NAD+, and 149.9/114 for [U-13C]-glutamine. Data were collected using Analyst software (v.1.7.1, SCIEX), and the relative amounts of metabolites were analysed using MultiQuant software (v.3.0.3, SCIEX). Note that a portion of ADP and ATP could lose one or two phosphate groups during in-source fragmentation thus leaving the same m/z ratios as AMP and ADP, which were corrected according to their different retention times in column./p>28%) in LC–MS-grade water (mobile phase A) and LC–MS-grade 90% (vol/vol) acetonitrile in HPLC water (mobile phase B) run at a flow rate of 0.25 ml min−1. The analytes were separated with the following gradient programme: 95% B held for 1 min, increased to 50% B in 6 min, held for 1 min, and the post time was set 2 min. The QTRAP mass spectrometer used an Turbo V ion source. The ion source was run in negative mode with a spray voltage of −4,500 V, gas 1 of 50 psi, gas 2 of 55 psi and curtain gas of 35 psi. Metabolites were measured using MRM, and declustering potentials and collision energies were optimized through use of analytical standards. The following transitions were used for monitoring each compound: 163.0/85.0 and 163.0/119.0 for 2-DG; 243.0/96.9, 243.0/78.9 and 243.0/139.0 for 2-DG6P and 149.9/114 for [U-13C]-glutamine. Data were collected and processed as in adenylates or NAD+ measurement./p> 0.05). For comparison between multiple groups with two fixed factors, an ordinary two-way ANOVA or two-way RM ANOVA (for example, for GTT and ITT data) was used, followed by Tukey's or Sidak's multiple-comparisons test. Geisser–Greenhouse correction was used where applicable. The adjusted means and s.e.m., or s.d., were recorded when the analysis met the above standards. Differences were considered significant when P < 0.05, or P > 0.05 with large differences of observed effects (as suggested in refs. 143,144). All specific statistical details can be found in the figure captions and statistical data. All images shown without biological replicates are representative of a minimum of three independent experiments./p>